Intégration de gènes ciblée pour les applications à haut débit

TL’édition génomique ciblée a fait de grands progrès au cours des dernières décennies, notamment grâce à l’avènement des systèmes d’édition génomique basés sur les endonucléases tels que CRISPR-Cas9. Cependant, l’insertion ciblée de charges utiles plus importantes reste problématique, ce qui entrave ce que les chercheurs peuvent faire en termes de capacité et de débit. Richard Davischercheur sur les cellules souches au centre médical de l’université de Leiden (LUMC) et chercheur associé au centre de la Fondation Novo Nordisk pour la médecine des cellules souches (reNEW), estime qu’un nouvelle stratégieappelée intégration de gènes assistée par la sérine et la tyrosine recombinase pour l’investigation à haut débit (STRAIGHT-IN), peut offrir aux scientifiques un nouvel outil puissant pour la recherche et les applications cliniques.¹

Édition précise du génome repose sur la réparation dirigée par homologie (HDR) pour incorporer l’ADN du donneur dans les régions ciblées.² Cependant, l’efficacité du ciblage HDR diminue de manière significative, à mesure que la taille de l’insertion augmente, l’insertion de charges utiles de plusieurs kilobases reste difficile.³ La recombinaison spécifique au site peut résoudre ce problème, et Davis et son équipe du LUMC ont utilisé les atouts de deux classes majeures de recombinase spécifique au site (SSR) pour créer STRAIGHT-IN. « Les recombinases à sérine peuvent rapidement introduire des constructions, mais l’ensemble du vecteur – squelette, plasmide, tout – s’intégrera », a déclaré Davis. « Nous savions par expérience que si ces séquences (inutiles) étaient conservées, le silence finirait par empêcher l’expression. Ainsi, nous avons utilisé des recombinases de tyrosine pour exciser ces séquences auxiliaires qui n’étaient pas nécessaires dans la lignée cellulaire finale.

Davis et les découvertes de son équipe, publié dans Méthodes de rapports de cellulesont montré que STRAIGHT-IN facilitait l’intégration ou la substitution ciblée de fragments génomiques de plusieurs kilobases tout en ne laissant que des traces (moins de 300 paires de bases) d’ADN du squelette plasmidique.¹ Cette capacité est importante pour créer des systèmes plus physiologiquement pertinents. « Nous voulions conserver tous les introns (endogènes) et éléments régulateurs ; pour conserver l’intégralité du contexte génomique du gène », a expliqué Davis. Davis a également noté que dans le passé, l’insertion de charges utiles importantes nécessitait souvent des manipulations des génomes cellulaires potentiellement altérantes le phénotype. Cela était particulièrement problématique pour les chercheurs en cellules souches. « Ces modifications supplémentaires pourraient impliquer l’élimination ou la surexpression de certains gènes, ce qui affecterait alors leur phénotype et leur capacité à se différencier », a déclaré Davis.

Les chercheurs ont conçu STRAIGHT-IN en pensant aux cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC), car le potentiel de ces cellules pour la recherche sur les maladies avait été entravé car elles étaient plus difficiles à modifier génétiquement que les lignées cellulaires immortalisées. « La technologie STRAIGHT-IN va jouer un rôle en rendant les modèles (hiPSC) plus utiles », a déclaré David Largaespada, un généticien de la faculté de médecine de l’Université du Minnesota qui n’était pas associé à cette étude. « Par exemple, nous avons du mal à imiter ce qui se passe dans le génome humain du cancer chez la souris, car les chromosomes murins sont différents. Avec les modèles hiPSC, nous pourrions potentiellement modéliser des éléments plus pertinents pour le cancer humain, comme des événements d’amplification génique, des événements de détournement d’amplificateurs, etc.

En plus des capacités, Davis et son équipe souhaitaient améliorer la vitesse et le débit de génération de modèles. Ils ont développé une procédure dans laquelle ils ont remplacé le gène d’intérêt par une cassette d’atterrissage contenant des sites de reconnaissance et d’attachement SSR, créant ainsi une « lignée cellulaire acceptrice » qui sert de modèle pour une manipulation future. Désormais, soit le gène original d’intérêt, soit un variant pourraient être insérés sans qu’il soit nécessaire de développer à chaque fois une procédure entièrement nouvelle, et la séquence serait placée dans son contexte génomique endogène. « En règle générale, le ciblage Cas9 nécessite trois à six mois », a expliqué Davis. « Mais disposer d’un système permettant à quelqu’un de réintroduire rapidement le gène avec différentes variantes est beaucoup plus rapide, même avec le temps nécessaire pour l’établir. » Cette approche a également permis le multiplexage, ce que Davis et ses collègues ont démontré en introduisant des plasmides correspondant à douze mutations différentes dans une population cellulaire et en récupérant onze d’entre eux à partir d’une seule transfection.

Le potentiel de STRAIGHT-IN est peut-être mieux mis en valeur par son haut plafond. Davis et d’autres acteurs du domaine s’attaquent déjà aux obstacles immédiats, tels que la recherche de SSR potentiellement meilleurs et le travail sur la délivrance dans des cellules différenciées. L’équipe de Davis a déjà introduit STRAIGHT-IN v2, qui a supprimé le besoin d’une étape d’isolement clonal en atteignant une efficacité de 100 %.⁴ Enfin, Largaespada a noté que Davis et son équipe ont mis à la disposition d’autres scientifiques des vecteurs et des lignées cellulaires avec des sites SSR déjà intégrés : « Je pense que ce sera assez facile à (introduire) et à mettre à l’échelle – ce serait tout à fait faisable pour de nombreux laboratoires, et nous y réfléchissons nous-mêmes.

Les références

1. Blanch-Asensio A, et al. STRAIGHT-IN permet le ciblage à haut débit de grandes charges utiles d’ADN dans les cellules souches pluripotentes humaines. Méthodes de représentation cellulaire. 2022 ; 2(10):100300.
2. Miyaoka Y, et al. La quantification systématique du HDR et du NHEJ révèle les effets du locus, de la nucléase et du type de cellule sur l’édition du génome. Représentant scientifique. 2016;6:23549.
3. Zhang M, et coll. Élargir le potentiel de l’ingénierie du génome des mammifères via une intégration ciblée de l’ADN. ACS Synthé Biol. 2021;10(3):429-446.
4. Blanch-Asensio A, et al. Génération de lignées iPSC humaines accepteurs AAVS1 et CLYBL STRAIGHT-IN v2 pour l’intégration de charges utiles d’ADN. Res de cellules souches. 2023;66:102991.