Éviter les conséquences involontaires de l’édition génétique

Tgrâce à des outils d’édition génétique tels que CRISPR-Cas Grâce à ces technologies, les chercheurs peuvent désormais insérer, supprimer ou remplacer l’ADN génomique sur des sites cibles spécifiques pour inactiver des gènes, acquérir de nouveaux traits et corriger des mutations génétiques.¹ Le système bien connu CRISPR-Cas9 repose sur un ARN guide qui dirige l’enzyme Cas9 vers une séquence d’ADN souhaitée, que l’enzyme coupe, formant des cassures double brin (DSB). Une application importante de la technologie CRISPR-Cas9 est de renforcer potentiellement la réponse immunitaire chez les patients atteints de cancer en concevant des cellules T autologues pour cibler et détruire les cellules tumorales.²

Alors que l’édition du génome CRISPR-Cas9 permet des thérapies avancées par les lymphocytes T, les scientifiques ont Les préoccupations de sécurité.³ Une réparation inappropriée du DSB peut entraîner la perte de chromosomes ciblés par Cas9, mais ces effets involontaires restent largement inexplorés. « Il y a eu quelques articles dans le domaine qui ont présenté cela (la perte de chromosomes), mais rien de très complet », a déclaré Connor Tsuchida de l’Université de Californie à Berkley et fondateur de la société de biotechnologie Stealth Startup. Dans son article récemment publié dans CelluleTsuchida et ses collègues ont rapporté l’ampleur de la perte chromosomique induite par Cas9 lors de l’édition de cellules T humaines.⁴

Pour étudier comment la modification du gène Cas9 affecte les cellules T, les chercheurs ont ciblé le premier exon du TRAC locus, qui code pour le récepteur des lymphocytes T sur le chromosome 14. Comme prévu, les résultats du séquençage de l’ADN ont montré que le locus prévu avait été modifié. Cependant, lorsque les chercheurs ont analysé les données de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) à l’échelle du transcriptome des cellules, ils ont détecté une dose réduite de gènes sur le chromosome 14 et ont constaté que cinq à 20 pour cent des cellules T présentaient une perte partielle ou totale du chromosome.

Pour approfondir le phénomène de perte de chromosomes, Tsuchida et ses collègues ont utilisé CRISPR-Cas9 pour modifier plusieurs gènes sur chaque chromosome somatique. Ils ont constaté que la perte de chromosomes s’est produite pour près de 90 pour cent de toutes les cibles, quel que soit l’endroit où la modification a eu lieu. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la perte de chromosomes due à l’édition du génome des lymphocytes T est une caractéristique générale de l’édition Cas9 sur les sites cibles.

Les chercheurs ont ensuite évalué les conséquences de la perte de chromosomes induite par Cas9. Ils ont surveillé les cellules modifiées in vitro pendant deux à trois semaines, un délai similaire aux protocoles actuels de fabrication de thérapies cellulaires T adoptives cliniques, et ont découvert que même si ces cellules ont survécu, elles présentaient des niveaux détectables de perte de chromosomes et présentaient une prolifération et une forme physique réduites. Par conséquent, les cellules T compromises présentant une perte de chromosomes induite par Cas9 pourraient persister suffisamment longtemps pendant la fabrication de la thérapie cellulaire pour se retrouver chez les patients. Les chercheurs ont également constaté une surexpression significative de deux modules génétiques dans ces cellules : la réponse aux dommages de l’ADN p53 et les voies générales de l’apoptose.

Les chercheurs se sont demandés s’ils pourraient trouver des preuves d’une perte de chromosomes des cellules T artificielles dans les essais cliniques existants.² Ils ont étudié les données scRNA-seq tout au long d’un essai achevé en 2020, dans lequel des patients atteints d’un cancer avancé et réfractaire ont reçu des cellules T éditées par CRISPR-Cas9, appelées cellules éditées CRISPR 3X transduites par NY-ESO-1 (cellules NYCE). « Nous n’avons trouvé aucune (perte de chromosomes), ce qui était surprenant pour nous », a déclaré Tsuchida.

Après avoir étudié plusieurs facteurs pouvant expliquer cette divergence, Tsuchida et ses collègues ont découvert une différence clé dans le protocole d’ingénierie des lymphocytes T de l’essai clinique. Dans l’étude de Tsuchida et dans presque tous les autres essais cliniques testant les cellules T modifiées par le génome, l’édition CRISPR s’est produite après l’activation et la stimulation des cellules T. En revanche, les cellules NYCE ont été modifiées avant l’activation, ce qui pourrait réduire la perte de chromosomes.

« L’important est que (l’équipe de Tsuchida) ait démontré un moyen d’atténuer la perte involontaire de chromosomes en modifiant le protocole », a déclaré Ayal Hendel, chercheur en édition CRISPR de l’Université Bar-Ilan, qui n’a pas participé à cette étude. « Ils ont démontré que si vous prenez d’abord les lymphocytes T, induisez des modifications, puis commencez seulement plus tard par l’activation… vous obtenez moins de perte de chromosomes. C’est la principale nouveauté de cet article.

Pour mieux comprendre la différence entre ces deux protocoles, les chercheurs ont examiné TP53 expression. Ce gène code pour la protéine p53 impliquée dans la réponse aux dommages de l’ADN et l’activation des lymphocytes T. Ils ont trouvé que TP53 l’expression après édition CRISPR-Cas9 était inversement corrélée aux taux de perte de chromosomes. Les chercheurs ont émis l’hypothèse que lors de la conception de cellules NYCE, TP53 l’expression peut avoir favorisé les cellules avec des chromosomes intacts. La modulation de p53 tout en suivant le protocole NYCE peut aider à protéger les cellules conçues par CRISPR contre l’aneuploïdie. « (Traiter les cellules) avec de petites molécules qui activent p53 ou inactivent un inhibiteur de p53 avant l’édition du génome… peut (offrir) une protection transitoire », a émis l’hypothèse de Tsuchida. « C’est quelque chose dans lequel nous souhaitons nous lancer. »

Les références:

1. Xu Y, et al. Systèmes CRISPR-Cas : aperçu, innovations et applications dans la recherche sur les maladies humaines et la thérapie génique. Comput Struct Biotechnologie J. 2020;18:2401-2415.
2. Stadtmauer EA, et coll. Cellules T conçues par CRISPR chez des patients atteints d’un cancer réfractaire. Science. 2020;367(6481):eaba7365.
3. Nahmad AD, et coll. Aneuploïdie fréquente dans les cellules T humaines primaires après clivage CRISPR-Cas9. Nat Biotechnologie. 2022;40(12):1807-1813.
4. Tsuchida CA, et al. Atténuation de la perte de chromosomes dans les cellules T cliniques conçues par CRISPR-Cas9. Cellule. 2023;186(21):4567-4582.e20.