WLorsque les scientifiques ont commencé à appliquer CRISPR pour l’édition du génome des cellules humaines, cela a ouvert les vannes de l’étude de la génétique des maladies. Aux premiers jours de l’édition avec CRISPR-Cas9, chercheur en oncologie de précision Francisco Sánchez-Rivera était un étudiant diplômé étudiant la génétique du cancer à Tyler Jacks‘laboratoire du Massachusetts Institute of Technology (MIT). Au cours de ses études supérieures, il a été parmi les premiers à modifier les génomes de souris avec CRISPR-Cas9 en interrogeant les facteurs génétiques du cancer du poumon. Ces études ont relancé l’intérêt de Sánchez-Rivera pour l’édition du génome à haut débit, qui alimente ses recherches actuelles au MIT.
Le chercheur en oncologie de précision Francisco Sánchez-Rivera crée des outils de recherche à haut débit pour étudier comment la variation génétique façonne la physiologie et la maladie normales.
Steve Boxall
Dans un récent Biotechnologie naturelle étude, Sánchez-Rivera a collaboré avec un biochimiste David Liu à l’Université Harvard pour examiner le gène du cancer le plus fréquemment muté : TP53qui code le gardien du génome, protéine suppresseur de tumeur p53. Ils ont étudié des milliers de variantes de p53 avec une nouvelle bibliothèque de capteurs d’édition principale à haut débit qui évalue quantitativement comment différentes mutations affectent la fonction des protéines endogènes.
Sánchez-Rivera et son équipe ont découvert que certaines mutations provoquent des phénotypes qui diffèrent de ceux observés précédemment dans les systèmes modèles de surexpression, en particulier ceux affectant le domaine d’oligomérisation qui permet aux protéines p53 de former des tétramères fonctionnels dans les cellules. Les travaux de Sánchez-Rivera soulignent l’importance du dosage des gènes endogènes dans la recherche sur la génétique des tumeurs et établissent un cadre pour l’interrogation de variantes génétiques à grande échelle pour les futures découvertes en médecine de précision.
Qu’est-ce qui vous a inspiré à étudier la génétique du cancer avec un montage principal ?
Le système CRISPR-Cas9 n’est pas bien adapté à l’ingénierie de mutations spécifiques liées au cancer, telles que les variantes mononucléotidiques, les polymorphismes mononucléotidiques, les insertions et les délétions, ainsi que différents types de réarrangements chromosomiques. Durant ma formation postdoctorale auprès d’un biologiste du cancer Scott Lowe au Memorial Sloan Kettering Cancer Center, j’ai réorienté mes efforts vers des technologies d’édition de précision du génome telles que l’édition de bases de cytosine et d’adénine, initialement développées dans le laboratoire de David Liu par Alexis Komor (maintenant biochimiste à l’Université de Californie, San Diego) et Nicole Gaudelli (maintenant entrepreneur chez Google Ventures), respectivement. Ces technologies nous ont permis de concevoir des altérations spécifiques d’un seul nucléotide dans les génomes cellulaires et de réaliser une édition du génome somatique in vivo chez la souris. Cela a conduit à réorienter l’édition des bases CRISPR vers la génomique fonctionnelle à haut débit, ouvrant ainsi la voie à notre principal travail d’édition. Montage principal a été développé par David Liu et Andrew Anzalone (maintenant directeur de Prime Medicine), et c’est vraiment ce que je considère comme le Saint Graal de l’édition précise du génome car il nous permet de concevoir pratiquement n’importe quel type de mutation.
Comment mesurez-vous l’édition du génome lors des écrans CRISPR à haut débit ?
L’ARN guide de la nucléase Cas9 (ARNg) original brise l’ADN et induit généralement une perte de fonction ou des mutations inactivantes. Dans ce contexte, les décomptes d’ARNg collectés par séquençage de nouvelle génération fournissent une mesure indirecte des propriétés favorisant la condition physique d’un guide. Pour l’édition de base et l’édition principale, s’appuyer sur le nombre d’ARNg dans une cellule n’est pas aussi précis ou quantitatif. Nous avons développé des bibliothèques de capteurs pour atténuer ces défis.
Que sont les bibliothèques de capteurs et comment fonctionnent-elles ?
Cela nous permet de quantifier simultanément l’efficacité et la précision de l’édition de chaque pegRNA au sein d’une bibliothèque telle qu’elle se produit dans les cellules.
-Francisco Sánchez-Rivera, Massachusetts Institute of Technology
Les bibliothèques de capteurs sont des constructions qui codent pour un ARNg et une version synthétique du site cible dans la même construction. Même s’il s’agit d’un site cible synthétique que nous concevons et clonons, dans le contexte d’une bibliothèque de capteurs, ce site cible est conçu pour imiter le plus fidèlement possible le site endogène. Nous incluons le site cible et les séquences d’ADN adjacentes, qui sont basées sur la séquence du locus endogène.
Nous avons montré précédemment que nous pouvions obtenir une mesure indirecte de la édition de base événements qui se produisaient de manière endogène lors du séquençage de ce site cible synthétique dans la construction lors d’un criblage à haut débit.2 Dans cette étudenous avons pris une page de ce livre et construit une bibliothèque de capteurs d’édition de premier ordre.1
L’ARN guide d’édition principal (pegRNA) est une construction plus compliquée en général, mais le concept est le même. Si nous introduisons ces bibliothèques dans des cellules qui expriment une machinerie d’édition principale, le pegRNA au sein de la construction éditera son site cible dans le capteur, et si les bibliothèques sont délivrées dans des cellules de la même espèce cible, le pegRNA éditera le site génomique endogène. C’est puissant car cela nous permet de quantifier simultanément l’efficacité et la précision de l’édition de chaque pegRNA au sein d’une bibliothèque telle qu’elle se produit dans les cellules.
Pourquoi vous êtes-vous concentré sur p53 lors du développement de bibliothèques de capteurs d’édition principale ?
Nous avons utilisé p53 comme prototype pour plusieurs raisons. Le gène qui code p53 est le gène cancéreux le plus fréquemment mutéet il y a encore beaucoup de controverses sur l’action de ces mutations.3
p53 est un facteur de transcription qui forme des tétramères actifs par le biais d’interactions protéine-protéine, qui facilitent la liaison à l’ADN et les fonctions suppresseurs de tumeurs. En tant que gène cancéreux le plus couramment muté, les scientifiques ont identifié des milliers de variantes de p53 liées à la maladie.
Chaque cellule humaine commence par deux copies p53 de type sauvage. En règle générale, le premier événement qui se produit lorsqu’une cellule acquiert une mutation p53 est une mutation ponctuelle dans une copie, suivie d’un événement de perte d’hétérozygotie, qui mute ou perd la seconde. TP53 copie du gène. Un certain nombre d’études ont utilisé des approches de mutagenèse exogène basées sur l’ADNc ou d’analyse mutationnelle profonde pour surexprimer différents mutants qui couvrent l’ensemble du spectre. TP53 gène. Ces études ont été réalisées sur des cellules exprimant p53 de type sauvage, telles que les cellules d’adénocarcinome du poumon que nous avons utilisées dans notre étude.
En termes génétiques, la seule propriété qui peut être mesurée grâce à cette approche est l’activité négative dominante, ce qui signifie que le mutant est introduit dans le contexte du tétramère de type sauvage et que l’activité négative dominante interfère avec ce pool p53 de type sauvage. Mais certains mutants peuvent avoir d’autres propriétés, pas seulement une activité négative dominante.
Nous voulions atteindre le point où nous pourrions tester rigoureusement ce modèle, et ce travail n’est qu’un début. Grâce à l’édition principale, nous avons conçu des mutations endogènes, en maintenant la stœchiométrie, le dosage des gènes et la manière native dont ces mutations apparaissent et progressent. Cette méthode nous a également permis d’établir la technologie de manière très rigoureuse, car nous avons appliqué une sélection rigoureuse aux cellules présentant une activité p53 altérée. Nous avons donc rapidement eu une idée de la robustesse et de l’évolutivité de la technologie.
Quelles sont les orientations futures ?
Ce domaine évolue rapidement mais nous souffrons parfois de son évolution si rapide que nous oublions de faire les expériences les plus importantes. L’interrogation mécanique de ces mutants fait définitivement partie de nos prochaines étapes. Nous revenons aux modèles de souris pour concevoir différents types de mutations dans divers tissus afin de comprendre ce qu’elles font in vivo. En plus de modéliser des mutations individuelles, nous sommes impatients de réaliser une édition multiplex principale dans le contexte d’une expérience génétique à plus haut débit sur des modèles de souris, tout comme nous l’avons fait dans les cellules.
Cette interview a été éditée pour des raisons de longueur et de clarté.
Les références
- Gould SI, et al. Évaluation à haut débit de variantes génétiques avec des bibliothèques de capteurs d’édition de premier ordre. Nat Biotechnologie. Publié en ligne le 12 mars 2024. est ce que je:10.1038/s41587-024-02172-9
- Sánchez-Rivera FJ, et al. Bibliothèques de capteurs d’édition de base pour l’ingénierie à haut débit et l’analyse fonctionnelle de variantes de nucléotides uniques associées au cancer. Nat Biotechnologie. 2022;40(6):862-873.
- Huang J. Développements actuels du ciblage de la voie de signalisation p53 pour le traitement du cancer. Pharmacol Ther. 2021;220:107720.
