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Qu’est-ce que le Western Blotting ?
Le Western blotting, également connu sous le nom d’immunoblotting, est une technique de biologie moléculaire courante que les scientifiques utilisent pour détecter et analyser protéines dans un échantillon biologique.1 Les protéines totales de l’échantillon sont séparées par taille par électrophorèse sur gel, puis transférées sur une membrane de nitrocellulose, où des protéines cibles spécifiques sont marqué à l’aide d’anticorps afin qu’ils puissent être visualisés.2
Southern, Northern et Western Blot : quelle est la différence ?La principale différence entre les techniques de Southern, Northern et Western blot réside dans les molécules ciblées. Alors que les Western blots ciblent les protéines d’un échantillon, les Southern blots révèlent l’ADN et les Northern blots indiquent l’ARN.3 Ces techniques utilisent généralement des méthodes de séparation de taille et de transfert similaires, mais des approches de liaison et de détection différentes. |
À quoi servent les Western blots ?
Les Western blots ne déterminent pas l’abondance absolue d’une protéine cible dans un échantillon, mais plutôt la présence ou l’absence de la protéine cible dans un échantillon, ainsi que la abondance relative de la protéine cible entre différents échantillons.1
Par exemple, si un scientifique souhaite produire de grandes quantités d’une protéine particulière dans une lignée cellulaire immortalisée in vitro, mais ne sait pas quelle lignée cellulaire choisir pour cette application, il peut prendre plusieurs lignées cellulaires courantes différentes, telles que les cellules HEK293, HeLa et CHO, transfecter un flacon de chaque lignée cellulaire avec un gène cible et cultiver les cellules pendant quelques semaines avant d’analyser leur teneur en protéines par Western blot.
En extrayant et en mesurant la concentration totale en protéines de chaque lignée cellulaire et en effectuant un Western blot, le chercheur peut déterminer quelles lignées cellulaires sont capables d’exprimer la protéine, et parmi celles qui faire produire la protéine qui en produit le plus.
Protocole de Western Blot
Les principales étapes d’un protocole de Western blot sont les suivantes.
- Préparation d’échantillons, y compris l’extraction et la quantification des protéines
- Séparation des protéines par électrophorèse sur gel
- Transfert membranaire de protéines à partir du gel
- Immunoblot avec anticorps primaires et secondaires
- Détection de cible
Les chercheurs peuvent déterminer l’expression de protéines spécifiques en extrayant et en mesurant la concentration totale de protéines d’un échantillon, en séparant les échantillons par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et en effectuant un protocole de transfert Western standard.
Le scientifique
Préparation d’échantillons Western blot : extraction et quantification des protéines
La préparation des échantillons est une première étape cruciale pour réaliser un Western blot précis.4 Après avoir extrait la totalité des protéines des cellules ou des tissus, les chercheurs doivent mesurer la concentration de protéines dans chaque échantillon, par exemple en utilisant un test de Bradford.
La plupart des protocoles de Western blot suggèrent un maximum de 50 µg de protéines totales par échantillon ; quantité égale de protéines totales entre les échantillons est essentielle pour tout type de comparaison quantitative.4 Le chargement d’une quantité excessive de protéines totales peut entraîner des problèmes tels qu’une diminution de la liaison des protéines de faible abondance en raison des protéines abondantes saturer la membrane.2
Séparation des protéines par électrophorèse sur gel
Les scientifiques séparent les protéines totales dans un échantillon de Western blot par taille via une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE).
L’étape suivante d’un protocole de Western blot est l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE),3 et les scientifiques peuvent utiliser l’une des deux principales approches à ce stade de la préparation des échantillons. La première consiste à faire passer les protéines natives à travers le gel, en les séparant par leur charge, masse et structure (PAGE native).4
La deuxième méthode consiste à dénaturer l’échantillon par la chaleur, en dépliant les protéines et en brisant les complexes protéiques, puis en les enrobant de dodécyl sulfate de sodium (SDS), un détergent anionique qui confère à toutes les protéines une charge négative. Cette approche permet de séparer les protéines seulement par leur masse (PAGE SDS).4
Les chercheurs chargent les échantillons dans les puits d’un mince gel de polyacrylamide, où un courant électrique pousse les protéines à travers le gel matrice ; comme les protéines plus petites traversent le gel plus rapidement, elles sont séparées par taille.2 Une échelle de protéines contenant une gamme de poids moléculaires connus est incluse dans un puits pour déterminer la taille en kilodaltons (kDa) de la protéine cible.
Transfert membranaire
Une fois que les protéines ont été séparées par taille via PAGE, les scientifiques transfèrent les protéines sur une membrane, généralement constituée de nitrocellulose ou polyfluorure de vinylidène (PVDF).5 Le gel est soigneusement placé sur la membrane et pris en sandwich entre des papiers filtres et des tampons absorbants préalablement imbibés de tampon. Un courant électrique est ensuite appliqué pour faire migrer les protéines du gel vers la membrane.3
À ce stade, les scientifiques ont souvent tacher la membrane avec un colorant de liaison aux protéines réversible non spécifique tel que le Ponceau S ou le bleu de Coomassie pour déterminer si le transfert de protéines a réussi et s’il y a des imperfections dues aux bulles d’air entre le gel et la membrane pendant le transfert qui affecteront l’image résultante.4
Immunoblot avec anticorps primaires et secondaires
Après le transfert, les chercheurs incubent la membrane avec des anticorps pour permettre la détection de la cible. Le blocage avec des protéines de lait ou de l’albumine de sérum bovin (BSA) avant et pendant l’immunotransfert aide empêcher la liaison d’anticorps non spécifique sur la membrane.6 L’anticorps primaire, spécifique de la protéine cible d’intérêt, est dilué dans un tampon et incubé avec la membrane. Le temps et les conditions d’incubation varient selon les antigènes et les anticorps.
Plusieurs étapes de lavage entre les incubations d’anticorps primaires et secondaires éliminer tout anticorps primaire non lié et réduire le signal de fond.6 L’anticorps secondaire peut ensuite être appliqué. Conçu pour se lier à l’anticorps primaire, cet anticorps secondaire est conjugué à une enzyme, un isotope radioactif ou un colorant fluorescent qui permettra la détection.3
Détection de cible
Les scientifiques utilisent des outils d’imagerie pour visualiser les Western blots et détecter la protéine cible.7 Chimiluminescence améliorée (ECL) est la méthode la plus courante pour la détection de protéines cibles dans le Western blot,5 mais la fluorescence est également populaire. Comme l’anticorps secondaire se lie uniquement à l’anticorps primaire spécifique de la cible, le processus d’imagerie produira une bande sur la membrane si la cible est présente dans un échantillon.
Analyse Western Blot : Comment lire un Western Blot
Bandes sur un Western blot l’image révèle la présence, l’absence et l’abondance relative de la protéine cible.2 Si aucune bande n’est présente pour un échantillon, la cible est absente ou peut être à des concentrations indétectablement faibles. Si des bandes sont présentes, l’intensité de la bande peut révéler les quantités relatives de la cible entre les échantillons ;3 une bande forte peut indiquer qu’il y a plus de protéine cible présente dans un échantillon particulier, bien qu’un signal trop fort puisse indiquer une sursaturation qui est moins informative pour déterminer l’abondance relative des protéines.
Reprenons l’exemple précédent d’un scientifique essayant de décider quelle lignée cellulaire utiliser pour produire une protéine d’intérêt. Le chercheur peut comparer l’expression entre les cellules HEK293, HeLa et CHO en réalisant une imagerie par transfert Western. S’il ne voit aucune bande présente pour l’échantillon HEK293, une bande faible pour HeLa et une bande intense pour CHO, ces résultats indiquent ce qui suit.
- Les cellules HEK293 sont incapables de produire la protéine d’intérêt
- Les cellules HeLa et CHO peuvent toutes deux produire la protéine d’intérêt
- Les cellules CHO peuvent produire la protéine la plus ciblée
Conseils de dépannage pour la tache Western tachetée
Les Western blots sont connus pour produire des images de mauvaise qualité, ce qui peut être dû à divers facteurs. Un problème courant qui contribue à un Western blot sombre et taché est la présence de bulles d’air entre le gel et la membrane pendant le transfert de protéines. Un petit rouleau doit être utilisé pour éliminer délicatement et soigneusement les poches d’air ou les bulles du sandwich de gel, garantissant ainsi un contact complet entre le gel et la membrane.
Laisser sécher la membrane à n’importe quel stade peut également entraîner une image sombre et tachetée, ce qui rend difficile la détection des bandes. Une agitation douce doit être appliquée pendant les incubations pour assurer une exposition uniforme et continue de la membrane à la solution.
Des bandes non spécifiques peuvent également être présentes sur un Western blot, souvent en raison de blocage insuffisantce qui peut contribuer à un signal de fond élevé.2 De plus, les anticorps primaires doivent être de haute qualité, validés par des contrôles positifs et négatifs et utilisés à la concentration optimale pour que la protéine cible évite une liaison non spécifique.2
Applications du Western Blot
Le test Western blot a une multitude d’applications, de la recherche fondamentale à la recherche appliquée. Les scientifiques utilisent souvent les Western blots comme outil de diagnostic. Par exemple, les chercheurs ont développé un test Western blot HSV pour déterminer la présence ou l’absence de anticorps contre le virus de l’herpès simplex-2 (HSV-2) dans des échantillons de taches de sang séché.8
De même, les scientifiques ont utilisé un test Western blot dans le diagnostic de la maladie de Lyme depuis le début des années 1990.9 Les chercheurs utilisent également des Western blots pour mesures de biomarqueurs dans le processus de développement de médicaments.dix
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