Effets génotoxiques des éditions Base et Prime

NDe nouveaux outils d’édition génétique pourraient changer la donne pour la thérapie génique, mais les scientifiques doivent développer de nouvelles approches qui limitent les mutations indésirables. Les courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées Le système (CRISPR)-Cas9 est l’un de ces outils d’édition sujets aux erreurs que les scientifiques ont ensuite modifié pour limiter son fardeau mutationnel.¹ Cependant, on ne sait pas exactement comment les techniques adaptées, appelées édition de base et principalecomparez-vous au système CRISPR-Cas9 d’origine.² Reportage dans le journal Biotechnologie naturelledes chercheurs de l’Institut scientifique San Raffaele ont révélé que édition de base et principale a produit plus de mutations que suggéré précédemment, mais les a produites moins souvent que CRISPR-Cas9.³

L’édition du gène CRISPR-Cas9 repose sur un ARN guide qui se lie à une séquence d’ADN souhaitée et sur une enzyme Cas9 qui coupe les deux brins d’ADN sur ce site, créant ainsi une cassure double brin. Les scientifiques modifient les séquences aux extrémités coupées avant d’utiliser différentes approches pour guider la réparation. Cependant, il existe souvent des séquences d’ADN supplémentaires avec des extrémités franches dans le noyau qui pourraient accidentellement se mélanger aux extrémités coupées lors de la réparation, conduisant à des mutations. Par conséquent, les chercheurs ont adapté les techniques CRISPR-Cas9 pour couper une base d’un brin tout en laissant le brin complémentaire intact, empêchant ainsi la jonction aléatoire d’extrémités émoussées et coupées conduisant à des mutations.²

Luigi Naldinichercheur en thérapie génique et co-auteur de l’étude, a dirigé analyses coûts-avantages de outils d’édition génétique tout au long de sa carrière.^4,5 Il a déclaré : « Il était évident pour nous que nous (devions) enquêter de la même manière pour savoir si l’édition de base offrait effectivement un avantage par rapport à la technologie d’édition précédente. » Il a émis l’hypothèse que lorsque le brin coupé se détache du brin complémentaire intact lors de la réplication, il pourrait servir de modèle pour créer un deuxième brin coupé. Cela créerait une double hélice d’ADN avec une extrémité émoussée qui pourrait rejoindre au hasard une autre extrémité émoussée, rendant ainsi l’ADN vulnérable aux mutations.

Voir également « Une alternative CRISPR pour corriger les mutations qui sensibilisent les cellules aux dommages à l’ADN»

Pour savoir si les éditeurs de base étaient vraiment moins sujets aux erreurs que les outils CRISPR-Cas9, l’équipe a comparé leurs performances d’édition d’ADN. Ils ont choisi de cibler le gène de la β2-microglobuline car il code pour une protéine de surface cellulaire facile à détecter et à quantifier avec des anticorps. En utilisant les deux technologies, ils ont modifié le gène des cellules souches hématopoïétiques (CSH), une cible courante de la thérapie génique pour troubles sanguins.⁶ Les deux outils ont supprimé le gène avec une efficacité comparable (environ 80 à 90 %), mais les éditeurs de base ont produit beaucoup moins de mutations indésirables que l’outil CRISPR-Cas9. Comme Naldini le soupçonnait, l’équipe a détecté des mutations résultant de cassures double brin dans les cellules éditées en base, bien qu’à un niveau inférieur à celui des cellules éditées par CRISPR-Cas9. Ces mutations se sont produites au niveau du site entaillé, ce qui suggère qu’il a été transformé en une cassure double brin accidentelle lors de la réplication. « Il est faux de dire que cette technologie est incassable », a déclaré Naldini.

L’équipe a également étudié si les systèmes d’édition déclenchaient des réponses cellulaires indésirables. L’outil CRISPR-Cas9 semble activer une voie de réparation de l’ADN régie par p53, une protéine connue sous le nom de «gardien du génome.»⁷ Cela était attendu pour un outil d’édition qui génère délibérément des ruptures double brin ; cependant, ils ont également détecté l’activation de p53 à un niveau réduit pour un éditeur de base spécifique qui convertit la cytosine en thymine.

CRISPR-Cas9 a surpassé les éditeurs de base sur un point : il n’a pas déclenché l’immunité innée. Les éditeurs de base utilisent de longs ARN guides qui sont considérés par la cellule comme étrangers, déclenchant réponses immunitaires.⁸

Ces réponses sont préoccupantes car le rendement des CSH éditées produites pour la thérapie génique n’est jamais de 100 pour cent. Au fil du temps, les cellules modifiées peuvent mourir si elles sont dépassées en nombre par celles non éditées et non gênées par les réponses au stress, réduisant ainsi la durabilité de la thérapie. « Il s’agit probablement d’une sélection négative des cellules qui ont connu peut-être le plus grand nombre de réponses et de résultats néfastes », a suggéré Samuele Ferraribiotechnologue et co-auteur de l’étude.

« Le message principal est probablement la sécurité de la nouvelle technologie », a déclaré Annarita Miccio, biologiste moléculaire à l’Institut Imagine, non impliqué dans les travaux. Son collègue Mégane Brussonqui n’a pas non plus été impliqué dans l’étude, a ajouté : « Il est vrai qu’il y a moins de risques génotoxiques avec les éditeurs de base et les éditeurs principaux, mais comme ils le montrent dans cet article, il existe encore certaines inquiétudes dont nous devons tenir compte lorsque nous développer des stratégies de thérapie génique ou d’édition du génome pour des approches thérapeutiques.

Heureusement, les chercheurs ont trouvé un moyen de réduire la plupart des effets génotoxiques des éditeurs de bases à un niveau indétectable en optimisant d’abord les ARN guides, puis en réduisant la dose utilisée. Pour prolonger la durée de vie de l’ARN, ils ont ajouté des fonctionnalités telles qu’un casquette 5 primes qui empêchent leur dégradation dans la cellule.⁹ Cependant, l’optimisation n’a pas complètement supprimé tous les effets indésirables. Les éditeurs de base déclenchaient toujours des mutations sur des sites aléatoires du génome au-delà du site cible.

Enfin, l’équipe a exploré le montage principal, l’autre technique de coupure. Au lieu de modifier une seule paire de bases, il supprime plusieurs bases d’un brin d’un gène et en insère de nouvelles à leur place.² « Il s’agit du dernier né parmi tous les outils d’édition », a déclaré Ferrari, ajoutant qu’en raison de ses balbutiements, « l’édition Prime n’a pas encore été testée en milieu clinique ».

Voir également « Prime Editing arrive à maturité»

Semblable à l’édition de bases, l’édition principale a conduit à des mutations au niveau du site de coupure qui signifiaient la formation accidentelle de cassures double brin et déclenchaient la voie de réparation de l’ADN p53 ainsi que la signalisation immunitaire. Comme pour l’édition de base, l’outil devra être optimisé pour éviter ces réponses cellulaires indésirables.

Les montages de base et principaux engendrent également des effets indésirables qui ne peuvent être repérés qu’avec un contrôle scrupuleux. « En tant que domaine, nous ne savons pas grand-chose des données des essais cliniques concernant, par exemple, les délétions à longue portée », a noté Ferrari.

Brusson a déclaré : « À l’avenir, nous aurons besoin d’une technologie plus puissante pour mieux caractériser les effets génotoxiques de la technologie d’édition de base et principale. »

Miccio et son équipe explorent édition de l’épigénome comme outil alternatif pour moduler les gènes en thérapie.^dix Ces outils activent ou répriment les gènes en modifiant la structure de la chromatine et n’introduisent pas de mutations dans le génome. « Ce serait théoriquement la stratégie la meilleure et la plus sûre qui permettrait d’éviter définitivement tous ces effets génotoxiques car il n’y a aucune enzyme qui modifie l’ADN », a-t-elle déclaré.

Les régulateurs britanniques ont récemment approuvé CRISPR-Cas9 pour traiter la drépanocytose et la β-thalassémie, et les chercheurs ont déjà utilisé des cellules éditées par des bases. traiter la leucémie chez une jeune fille de 13 ans au Royaume-Uni.¹¹ Bien que ces outils d’édition aient le potentiel de sauver des vies, cette étude suggère qu’il pourrait être utile d’examiner plus en détail leurs risques génotoxiques.

Les références

1. Doudna JA & Charpentier E. La nouvelle frontière de l’ingénierie du génome avec CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
2. Kantor A, et al. Édition de bases et édition d’amorces d’ADN CRISPR-Cas9. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6240.
3. Fiumara M, et al. Effets génotoxiques de l’édition de base et d’origine dans les cellules souches hématopoïétiques humaines. Nat Biotechnologie. 2023;s41587-023-01915-4.
4. Gabriel R, et coll. Une analyse impartiale de la spécificité de la nucléase à doigt de zinc à l’échelle du génome. Nat Biotechnologie. 2011;29 : 816-823.
5. Ferrari S, et coll. Édition génétique efficace de cellules souches hématopoïétiques humaines à long terme validée par suivi clonal. Nat Biotechnologie. 2020;38(4):1298-1308.
6. Antoniou P, et al. Technologies d’édition de base et principales pour les troubles sanguins. Front Génome Ed. 2021;3:61846.
7. Feroz W et Cheikh AMA. Explorer les multiples rôles de gardien du génome : P53. Egypte J Med Hum Genet. 2020;21(49):s43042-020-00089-x.
8. Schubert MS, et al. Modification chimique de CRISPR ARNg éliminer les réponses à l’interféron de type I dans les cellules mononucléées du sang périphérique humain. J Cytokine Biol. 2018;3(21):121.
9. Gerstel B, et al. Les effets du coiffage 5′, de la 3′-polyadénylation et de la composition leader sur la traduction et la stabilité de l’ARNm dans un extrait acellulaire dérivé de la levure Saccharomyces cerevisiae. Mole Microbiol. 1992;6(16):2339-2348.
10. Syding LM, et al. Potentiel d’édition de l’épigénome CRISPR/Cas9 pour les maladies rares à empreinte : une revue. Cellules. 2020 ;9(4):993.
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